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轉(zhuǎn)染技術要點

 更新時間:2022-05-23 點擊量:1177
  1. 細胞培養(yǎng)物 健康的細胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎。不同細胞有不同的培養(yǎng)基,血清和添加物。低的細胞代數(shù)(<50)能確?;蛐筒蛔?。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細胞密度,一般的轉(zhuǎn)染試劑都會有專門的說明。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時分細胞,這將提供正常細胞代謝,增加對外源DNA攝入的可能。一定要避免細菌,支原體或真菌的污染。
 
  2. 血清大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。胎牛血清(FCS)經(jīng)常用到,便宜一點的有馬或牛血清。通常的,血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物,對不同細胞的生長作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。因此在轉(zhuǎn)染前建議先測(轉(zhuǎn)右) 試出對細胞生長良好的血清批號,轉(zhuǎn)染時用同一批號的血清,并同時做負對照(不加轉(zhuǎn)染試劑及外源DNA)以測試細胞生長是否正常。有些轉(zhuǎn)染技術如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低,因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對此敏感的細胞如原代細胞會受到損傷,甚至死亡導致轉(zhuǎn)染效率極低。
 
  3. 載體構建 轉(zhuǎn)染載體的構建(病毒載體,質(zhì)粒DNA,RNA,PCR產(chǎn)物,寡核苷酸等)也影響轉(zhuǎn)染結果。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高,但不同病毒載體有其特定的宿主,有的還要求特定的細胞周期,如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞,此外還需考慮一些安全問題(如基因污染)。除載體構建外,載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響,如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用,轉(zhuǎn)染也很難進行,因此選擇組成或可調(diào)控,強度合適的啟動子也很重要,同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾。
 
  4. DNA質(zhì)量 DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(如脂質(zhì)體等)基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。核酸純化**品牌德國QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒,能達到兩倍2x CsCl梯度離心以上的純度效果,使您不必為DNA質(zhì)量操心。此外,對一些內(nèi)毒素敏感的細胞(如原代細胞,懸浮細胞和造血細胞),QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒,在質(zhì)粒抽提過程中有效去除脂多糖分子,保證理想的轉(zhuǎn)染效果。
 
  5.轉(zhuǎn)染技術轉(zhuǎn)染技術的選擇對轉(zhuǎn)染結果影響也很大,許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例,細胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測時間等。
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